استخراج RNA یکی از مراحل کلیدی در بسیاری از مطالعات زیست‌شناسی مولکولی، بیوتکنولوژی و تشخیص‌های پزشکی است. روش‌های مختلفی برای استخراج RNA وجود دارد که بر اساس نیازهای تحقیقاتی و ویژگی‌های نمونه انتخاب می‌شوند. در ادامه، مهم‌ترین روش‌های استخراج RNA را معرفی می‌کنیم:
انواع روش های استخراج RNA
1. روش فنل-کلروفرم (TRIzol یا روش دستی)
این روش که به روش Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction نیز معروف است، یکی از رایج‌ترین و کارآمدترین روش‌های استخراج RNA است.
-
مراحل کار:
- لیز سلولی با استفاده از بافر حاوی فنل، کلروفرم و گوانیدینیوم تیوسیانات.
- تفکیک فازها: اضافه کردن کلروفرم و سانتریفیوژ کردن برای جداسازی RNA در فاز آبی.
- رسوب‌دهی RNA: با استفاده از ایزوپروپانول و شستشو با اتانول.
- مزایا: کیفیت و بازده بالا، حفظ یکپارچگی RNA.
- معایب: استفاده از مواد شیمیایی سمی (فنل و کلروفرم)، نیاز به مهارت بالا.
2. روش استخراج ستونی (کیت‌های استخراج RNA)
در این روش از ستون‌های سیلیکایی برای جداسازی RNA استفاده می‌شود. نمونه‌ها ابتدا با بافرهای مخصوص تیمار شده و RNA به سطح ستون متصل می‌شود، سپس با شستشو و شفاف‌سازی، RNA خالص استخراج می‌شود.
- مزایا: سرعت بالا، عدم نیاز به مواد شیمیایی خطرناک، تکرارپذیری بالا.
- معایب: هزینه بیشتر نسبت به روش TRIzol، امکان استخراج کمتر در مقایسه با روش‌های دستی.
3. روش مغناطیسی (Beads-Based RNA Extraction)
در این روش از ذرات مغناطیسی پوشش داده‌شده با مواد جاذب RNA برای جداسازی RNA استفاده می‌شود.
- مزایا: مناسب برای اتوماسیون، افزایش خلوص RNA، کاهش آلودگی.
- معایب: هزینه بالا، نیاز به تجهیزات مغناطیسی.
4. استخراج RNA به روش LiCl (لیتیوم کلرید)
در این روش از LiCl برای رسوب‌دهی اختصاصی RNA استفاده می‌شود.
- مزایا: حذف DNA و پروتئین‌ها، مناسب برای RNAهای بلند.
- معایب: بازده کم برای RNAهای کوچک، زمان‌بر بودن.
5. روش‌های اتوماسیون شده (Automated RNA Extraction)
این روش‌ها شامل استفاده از دستگاه‌های اتوماسیون استخراج RNA هستند که معمولاً بر اساس یکی از روش‌های بالا کار می‌کنند.
- مزایا: سرعت و دقت بالا، کاهش آلودگی و خطای انسانی.
- معایب: هزینه بسیار بالا، نیاز به تجهیزات پیشرفته.
جمع‌بندی و مقایسه
| روش |
مزایا |
معایب |
| TRIzol (فنل-کلروفرم) |
بازده بالا، ارزان |
مواد سمی، نیاز به مهارت |
| ستونی (کیت‌ها) |
سریع، آسان، ایمن |
گران‌تر، ممکن است بازده کمتری داشته باشد |
| مغناطیسی (Beads-Based) |
خلوص بالا، مناسب برای اتوماسیون |
هزینه بالا |
| LiCl لیتیوم کلرید |
حذف DNA و پروتئین‌ها |
بازده کم، زمان‌بر |
| لیز مستقیم (Direct Lysis) |
استخراج RNA از نمونه‌های کوچک و حساس |
خلوص کمتر |
اگر هدف شما دقت و بازده بالا باشد، روش TRIzol یا کیت‌های ستونی مناسب هستند. اگر سرعت و کاهش آلودگی مهم باشد، روش‌های مغناطیسی یا اتوماسیون‌شده بهترین انتخاب هستند.
کدام روش برای کار شما مناسب‌تر است؟
روش استخراج RNA با استفاده از فنل-کلروفرم (TRIzol) - قدم به قدم
روش فنل-کلروفرم که با نام TRIzol یا روش دستی نیز شناخته می‌شود، یکی از رایج‌ترین و موثرترین روش‌ها برای استخراج RNA کل از سلول‌ها و بافت‌های زنده است. این روش بر پایه جداسازی RNA از DNA و پروتئین‌ها در یک محلول چند فازی صورت می‌گیرد.
مواد و تجهیزات مورد نیاز
- TRIzol Reagent (یا سایر معرف‌های حاوی فنل-کلروفرم)
- کلروفرم
- ایزوپروپانول
- اتانول 70%
- RNase-Free Water (آب بدون RNase)
- تیوگلیسرول (اختیاری، برای حفاظت از RNA)
- سانتریفیوژ یخچال‌دار
- سمپلر و میکروتیوب (1.5 یا 2 میلی‌لیتری)
- دستکش و هود شیمیایی (برای کار با فنل)
- فریزر -80 درجه سانتی‌گراد (برای نگهداری RNA)
مراحل انجام کار
مرحله 1: لیز سلولی و همگن‌سازی (Homogenization)
🔹 هدف: شکستن سلول‌ها و آزاد کردن RNA در محلول TRIzol
🔹 روش:
- اگر از سلول‌های چسبنده استفاده می‌کنید، ابتدا محیط کشت را تخلیه کرده و با PBS شستشو دهید.
- اگر از سلول‌های معلق استفاده می‌کنید، ابتدا با سانتریفیوژ در 4 درجه سانتی‌گراد سلول‌ها را جمع‌آوری کرده و PBS را اضافه کنید.
- TRIzol را اضافه کنید (1 میلی‌لیتر TRIzol به ازای هر 1-5 میلیون سلول یا 50-100 میلی‌گرم بافت).
- به آرامی پیپتاژ کرده یا با هموژنایزر (یا سونیکاتور) سلول‌ها را کاملاً بشکنید.
- نمونه را برای 5-10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید تا RNA از پروتئین‌ها و لیپیدها جدا شود.
مرحله 2: جداسازی فازها با کلروفرم
🔹 هدف: جداسازی RNA از DNA و پروتئین‌ها
🔹 روش:
- به هر 1 میلی‌لیتر TRIzol مقدار 200 میکرولیتر کلروفرم اضافه کنید.
- به شدت (حدود 15 ثانیه) نمونه را ورتکس کنید یا لوله را چند بار بالا و پایین کنید.
- نمونه را به مدت 5-10 دقیقه در دمای اتاق بگذارید تا جداسازی انجام شود.
- نمونه را در 4 درجه سانتی‌گراد، با سرعت 12,000 تا 15,000 × g به مدت 10-15 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
✅ پس از سانتریفیوژ، سه فاز تشکیل می‌شود:
- فاز آبی (بالایی): حاوی RNA
- فاز بینابینی (سفید): حاوی DNA
- فاز آلی (پایینی، صورتی یا زرد): حاوی پروتئین و لیپیدها
مرحله 3: جداسازی RNA از فاز آبی
🔹 هدف: انتقال RNA از فاز آبی
🔹 روش:
- فاز بالایی (آبی) را با دقت و بدون تماس با فاز بینابینی، به یک لوله جدید و تمیز منتقل کنید.
- به ازای هر 1 میلی‌لیتر TRIzol اولیه، مقدار 500-600 میکرولیتر ایزوپروپانول اضافه کنید.
- نمونه را چند بار به آرامی وارونه کنید تا RNA به صورت رسوب ظاهر شود.
- نمونه را حداقل 10 دقیقه در -20 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید (اختیاری اما توصیه‌شده برای بهبود راندمان رسوب RNA).
- در 4 درجه سانتی‌گراد، با سرعت 12,000-15,000 × g به مدت 10-15 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
✅ در این مرحله RNA به‌صورت یک رسوب سفید در کف لوله ظاهر می‌شود.
مرحله 4: شستشو و خالص‌سازی RNA
🔹 هدف: حذف ناخالصی‌ها و باقی‌مانده نمک‌ها
🔹 روش:
- مایع رویی (سوپرناتانت) را به دقت دور بریزید (بدون تماس با رسوب RNA).
- به رسوب RNA، 1 میلی‌لیتر اتانول 70% (در آب RNase-Free) اضافه کنید.
- چند بار پیپتاژ کنید یا لوله را تکان دهید تا رسوب RNA در اتانول معلق شود.
- سانتریفیوژ در 4 درجه سانتی‌گراد، 7,500-10,000 × g به مدت 5 دقیقه.
- سوپرناتانت را دور ریخته و این مرحله را یک بار دیگر تکرار کنید.
- در نهایت، مایع را کاملاً خارج کرده و رسوب را در دمای اتاق یا 37 درجه خشک کنید (2-5 دقیقه).
مرحله 5: حل کردن RNA و ذخیره‌سازی
🔹 هدف: انحلال RNA در یک بافر مناسب
🔹 روش:
- 20-50 میکرولیتر آب RNase-Free یا بافر TE را به رسوب اضافه کنید.
- چند بار پیپتاژ کنید تا RNA به‌طور کامل حل شود.
- برای افزایش حلالیت، می‌توان RNA را به مدت 10 دقیقه در 55-60 درجه سانتی‌گراد انکوبه کرد (از دمای بالاتر از 65 درجه اجتناب کنید).
- RNA را در -80 درجه سانتی‌گراد برای نگهداری طولانی‌مدت ذخیره کنید.
بررسی کیفیت و کمیت RNA
🔹 برای ارزیابی کیفیت و غلظت RNA می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:
- اسپکتروفتومتری (NanoDrop یا UV-Vis): نسبت جذب A260/A280 باید بین 1.8 تا 2.2 باشد.
- الکتروفورز ژل آگارز: برای بررسی تخریب یا آلودگی RNA.
- Qubit یا RT-qPCR: برای بررسی خلوص و کیفیت در کاربردهای حساس.
نکات مهم و بهینه‌سازی
✅ از دستکش و هود شیمیایی استفاده کنید تا از تماس با فنل و کلروفرم جلوگیری شود.
✅ از RNase-Free Water و تجهیزات عاری از RNase استفاده کنید تا تخریب RNA کاهش یابد.
✅ دمای پایین (4 درجه و -20 یا -80 درجه) را رعایت کنید تا RNA پایدار بماند.
✅ اگر RNA تخریب شد، ممکن است نمونه آلوده به RNase باشد یا در مرحله سانتریفیوژ مشکلی رخ داده باشد.
جمع‌بندی
✔ این روش مقرون‌به‌صرفه و موثر است و RNA با کیفیت بالا برای RT-PCR، RNA-seq، Northern blot و سایر آنالیزهای مولکولی فراهم می‌کند.
✔ نیاز به مهارت دارد، اما نتایج عالی می‌دهد.
✔ اگر حجم نمونه کم است یا روش سریع‌تری می‌خواهید، کیت‌های استخراج ستونی RNA جایگزین مناسبی هستند.
💡 سوالی درباره این روش دارید؟ با ما درتماس باشید.
روش استخراج RNA با استفاده از کیت‌های ستونی (Silica Column-Based RNA Extraction) – قدم‌به‌قدم
استخراج RNA با استفاده از ستون‌های سیلیکایی یکی از سریع‌ترین و کارآمدترین روش‌ها برای جداسازی RNA با خلوص بالا است. در این روش، RNA به‌طور اختصاصی به یک ماتریس سیلیکایی درون ستون متصل می‌شود، سپس ناخالصی‌ها شسته شده و RNA خالص استخراج می‌شود.
مواد و تجهیزات مورد نیاز
✅ کیت استخراج RNA ستونی (محتویات معمولی کیت شامل موارد زیر است):
- Buffer RL یا RLT: بافر لیز سلولی حاوی گوانیدینیوم تیوسیانات (جهت تخریب سلول و غیرفعال‌سازی RNase).
- Buffer RW1 یا Wash Buffer 1: بافر شستشو برای حذف پروتئین‌ها و آلودگی‌ها.
- Buffer RW2 یا Wash Buffer 2: بافر شستشو نهایی برای حذف باقی‌مانده نمک‌ها.
- DNase (اختیاری): برای حذف DNA در برخی کیت‌ها.
- Elution Buffer (آب RNase-Free): برای حل کردن RNA در مرحله پایانی.
- ستون سیلیکایی (Spin Column): فیلتر مخصوص برای جذب RNA.
- تیوب‌های جمع‌آوری (Collection Tubes).
✅ تجهیزات مورد نیاز:
- سانتریفیوژ یخچال‌دار
- میکروتیوب‌های 1.5 یا 2 میلی‌لیتری
- هود شیمیایی (اختیاری)
- سمپلر و نوک فیلتر‌دار
مراحل انجام کار
مرحله 1: لیز و همگن‌سازی سلول‌ها یا بافت‌ها
🔹 هدف: شکستن سلول‌ها و آزاد کردن RNA
🔹 روش:
- سلول‌های کشت‌شده را با PBS شستشو داده و محیط را حذف کنید.
- برای سلول‌های چسبنده، مستقیماً 350-600 میکرولیتر بافر RL یا RLT (حاوی گوانیدینیوم تیوسیانات) را اضافه کنید و با پیپتاژ یا ورتکس همگن کنید.
- برای سلول‌های معلق، ابتدا آنها را سانتریفیوژ کرده، محیط را دور ریخته و سپس بافر RL اضافه کنید.
- اگر از بافت‌های جامد استفاده می‌کنید، ابتدا بافت را خرد کرده و در 1 میلی‌لیتر بافر RL هموژن کنید (با هاون مایع نیتروژن یا هموژنایزر مکانیکی).
- نمونه‌ها را به مدت 5-10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
مرحله 2: حذف DNA (اختیاری)
🔹 هدف: حذف آلودگی‌های DNA ژنومی
🔹 روش:
- برخی کیت‌ها دارای DNase هستند که برای حذف DNA ژنومی استفاده می‌شود.
- 50-100 میکرولیتر DNase mix را روی ستون اضافه کنید و 10 دقیقه انکوبه کنید.
- سپس بافر RW1 را اضافه کنید و سانتریفیوژ کنید.
مرحله 3: بارگذاری نمونه روی ستون سیلیکایی
🔹 هدف: اتصال RNA به ماتریس سیلیکایی
🔹 روش:
- مخلوط حاصل از مرحله قبل را به ستون سیلیکایی (Spin Column) منتقل کنید.
- در 12,000-15,000 × g به مدت 30-60 ثانیه سانتریفیوژ کنید.
- مایع زیر ستون (فاز دفع‌شده) را دور بریزید. (RNA به ستون متصل شده است.)
مرحله 4: شستشو و حذف ناخالصی‌ها
🔹 هدف: حذف پروتئین‌ها، نمک‌ها و سایر ناخالصی‌ها
🔹 روش:
- 700 میکرولیتر بافر RW1 را روی ستون بریزید و 12,000 × g به مدت 30 ثانیه سانتریفیوژ کنید.
- مایع دفع‌شده را دور بریزید.
- 500 میکرولیتر بافر RW2 را اضافه کنید و دوباره 12,000 × g به مدت 30 ثانیه سانتریفیوژ کنید.
- این مرحله را یک بار دیگر با RW2 تکرار کنید.
مرحله 5: حذف کامل بافر شستشو
🔹 هدف: حذف بقایای اتانول که ممکن است بر روی RNA تأثیر بگذارد
🔹 روش:
- سانتریفیوژ خشک: ستون را بدون هیچ مایعی در 12,000 × g به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا باقی‌مانده اتانول حذف شود.
- این مرحله برای جلوگیری از مهار واکنش‌های PCR و RT-PCR بسیار مهم است.
مرحله 6: بازیابی RNA (Elution)
🔹 هدف: آزادسازی RNA از ستون و جمع‌آوری آن
🔹 روش:
- ستون را به یک تیوب جدید RNase-Free منتقل کنید.
- 30-50 میکرولیتر آب RNase-Free یا بافر Elution را مستقیماً روی غشا بریزید.
- 5 دقیقه در دمای اتاق بگذارید تا RNA از غشا جدا شود.
- در 12,000 × g به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
- RNA در مایع پایین تیوب جمع‌آوری می‌شود.
📌 نکته: اگر RNA غلیظ‌تر می‌خواهید، از 30 میکرولیتر بافر Elution استفاده کنید. اگر می‌خواهید RNA بیشتری بازیابی شود، Elution را دو بار تکرار کنید.
بررسی کیفیت و کمیت RNA
🔹 برای ارزیابی کیفیت و غلظت RNA می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:
- اسپکتروفتومتری (NanoDrop یا UV-Vis): نسبت جذب A260/A280 باید بین 1.8 تا 2.2 باشد.
- الکتروفورز ژل آگارز: بررسی تخریب RNA و وجود باندهای rRNA.
- Qubit یا RT-qPCR: بررسی خلوص RNA برای کاربردهای حساس.
نگهداری RNA
✅ RNA را در -80°C برای نگهداری طولانی‌مدت ذخیره کنید.
✅ در صورت استفاده کوتاه‌مدت (چند روز تا یک هفته)، RNA را در -20°C یا بافر TE نگهداری کنید.
مقایسه روش ستونی و روش TRIzol
| ویژگی |
روش ستونی |
روش TRIzol |
| سرعت و سادگی |
سریع (30-45 دقیقه)، آسان |
زمان‌بر (1-2 ساعت)، نیاز به مهارت |
| ایمنی |
بدون مواد سمی |
شامل فنل و کلروفرم (مواد سمی) |
| خلوص RNA |
بالا، بدون آلودگی DNA و پروتئین |
ممکن است به DNase نیاز داشته باشد |
| بازیابی RNA |
متوسط (محدود به ظرفیت ستون) |
زیاد (بسته به رسوب‌دهی) |
| قیمت |
گران‌تر |
ارزان‌تر |
| کاربرد برای RNAهای کوچک |
محدودیت دارد |
مناسب برای همه انواع RNA |
جمع‌بندی
✔ روش ستونی سریع، ایمن و کاربرپسند است، اما گران‌تر از روش TRIzol است.
✔ برای کاربردهای حساس مثل RT-PCR، RNA-seq و qPCR مناسب است.
✔ برای کاربرانی که تجربه زیادی ندارند، این روش پیشنهاد می‌شود.
💡 سوالی درباره مراحل این روش دارید؟ با ما در تماس باشید و یا در کامنت بپرسید.
استخراج RNA با استفاده از نانوذرات مغناطیسی (Magnetic Beads-Based Extraction)
🔹 این روش از نانوذرات مغناطیسی پوشیده‌شده با سیلیکا یا ترکیبات خاص برای جداسازی RNA استفاده می‌کند.
🔹 میدان مغناطیسی خارجی به جداسازی سریع و کارآمد RNA کمک می‌کند، بدون نیاز به سانتریفیوژ.
مواد و تجهیزات مورد نیاز
✅ مواد شیمیایی:
- بافر لیز (Lysis Buffer): حاوی گوانیدینیوم تیوسیانات برای تخریب سلول و دناتوره کردن RNase.
- بافر اتصال (Binding Buffer): حاوی نمک‌های خاص برای افزایش اتصال RNA به نانوذرات.
- نانوذرات مغناطیسی (Magnetic Beads): پوشیده شده با سیلیکا یا پلی‌آنیون برای جذب RNA.
- بافرهای شستشو (Wash Buffers): شامل اتانول 70% و بافرهای نمکی برای حذف آلودگی‌ها.
- بافر شستشوی نهایی (Low-Salt Wash Buffer): برای حذف باقی‌مانده نمک‌ها.
- بافر Elution (آب RNase-Free یا TE Buffer): برای آزادسازی RNA از نانوذرات.
✅ تجهیزات:
- مگنت استند (Magnetic Stand) برای جدا کردن نانوذرات از محلول.
- پیپت‌های فیلتر‌دار برای جلوگیری از آلودگی RNase.
- هود تمیز (RNAse-Free Workstation)
- دستکش و لوله‌های RNase-Free
مراحل استخراج RNA با روش مغناطیسی
🔹 مرحله 1: لیز سلولی و آزادسازی RNA
- 100 تا 200 میکرولیتر از نمونه سلولی یا بافتی را در یک لوله میکروتیوب قرار دهید.
- 600 میکرولیتر بافر لیز اضافه کنید و به‌آرامی ورتکس کنید.
- برای تخریب کامل سلول‌ها، 5 تا 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
- اگر نمونه بافتی باشد، بافت را با هموژنایزر پردازش کنید.
- نمونه را در 12,000 × g به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا بقایای سلولی ته‌نشین شوند.
🔹 مرحله 2: اتصال RNA به نانوذرات مغناطیسی
- 200 میکرولیتر بافر Binding و 20-50 میکرولیتر نانوذرات مغناطیسی را اضافه کنید.
- مخلوط را ورتکس کرده و 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
- میدان مغناطیسی را اعمال کنید و اجازه دهید نانوذرات جذب شوند (حدود 1 دقیقه).
- فاز مایع را به‌آرامی دور بریزید، بدون اینکه نانوذرات را از دست بدهید.
🔹 مرحله 3: شستشو برای حذف آلودگی‌ها
🔸 شستشوی اول (اتانول 70%)
- 500 میکرولیتر اتانول 70% اضافه کنید و لوله را به‌آرامی ورتکس کنید.
- میدان مغناطیسی را اعمال کنید و مایع را به‌آرامی دور بریزید.
- این مرحله را 2 بار تکرار کنید.
🔸 شستشوی دوم (بافر Wash با نمک کم)
4. 500 میکرولیتر بافر Wash اضافه کنید و مخلوط را ورتکس کنید.
5. میدان مغناطیسی را اعمال کنید و مایع را دور بریزید.
🔸 شستشوی نهایی
6. نانوذرات را در دمای اتاق خشک کنید تا باقی‌مانده اتانول تبخیر شود.
🔹 مرحله 4: آزادسازی (Elution) RNA
- 50-100 میکرولیتر آب RNase-Free یا TE Buffer گرم (65°C) اضافه کنید.
- نمونه را 5 دقیقه در دمای 65°C انکوبه کنید.
- میدان مغناطیسی را اعمال کنید و RNA را از فاز مایع جمع‌آوری کنید.
- RNA را در -80°C ذخیره کنید.
🔬 بررسی کیفیت و کمیت RNA
- NanoDrop: بررسی نسبت جذب 260/280 و 260/230.
- ژل آگارز: بررسی تخریب یا آلودگی RNA.
- RT-PCR یا qPCR: ارزیابی کیفیت برای کاربردهای بیولوژی مولکولی.
✅ مزایا و معایب روش مغناطیسی
| ویژگی |
مزیت |
عیب |
| سرعت بالا |
استخراج در کمتر از 30 دقیقه |
- |
| عدم نیاز به سانتریفیوژ |
مناسب برای فرآیندهای خودکار و HTS |
نیاز به مگنت استند |
| خلوص بالا |
جداسازی RNA بدون DNA و پروتئین‌ها |
هزینه نسبتاً بالا |
| سازگاری با نمونه‌های کم |
مناسب برای RNAهای کمیاب |
نیاز به بهینه‌سازی برای انواع نمونه‌ها |
🔹 مقایسه روش‌های استخراج RNA
| روش |
خلوص |
سرعت |
ایمنی |
هزینه |
| TRIzol (فنل-کلروفرم) |
بالا |
متوسط |
سمی |
متوسط |
| ستونی (Silica Column) |
بالا |
سریع |
ایمن |
گران |
| مغناطیسی (Beads) |
بسیار بالا |
بسیار سریع |
ایمن |
نسبتاً گران |
| لیتیوم کلرید |
بسیار بالا |
کند |
ایمن |
متوسط |
📌 نتیجه‌گیری: روش مغناطیسی برای آزمایشگاه‌های خودکار، نمونه‌های کم و استخراج RNA با خلوص بالا بهترین گزینه است.
استخراج RNA با روش رسوب‌دهی لیتیوم کلرید (Lithium Chloride Precipitation)
🔹 روش لیتیوم کلرید (LiCl) برای استخراج RNA با خلوص بسیار بالا، مخصوصاً برای حذف DNA، پروتئین‌ها و پلی‌ساکاریدها استفاده می‌شود.
🔹 این روش برای RNAهای بزرگ‌تر از 200 نوکلئوتید مناسب است، اما RNAهای کوچک ممکن است از بین بروند.
📌 مواد و تجهیزات مورد نیاز
✅ مواد شیمیایی:
- لیتیوم کلرید (LiCl) 8M (برای رسوب دادن RNA)
- اتانول 70% (برای شستشو)
- آب RNase-Free یا بافر TE (برای حل کردن RNA)
- دی‌اتیل پیروکربنات (DEPC-Treated Water) (اختیاری، برای مهار RNase)
✅ تجهیزات:
- سانتریفیوژ یخچال‌دار (12,000 × g یا بیشتر)
- لوله‌های RNase-Free
- هود تمیز برای کار با RNA
- پیپت‌های فیلتر‌دار برای جلوگیری از آلودگی RNase
🔬 مراحل استخراج RNA با روش لیتیوم کلرید (LiCl Precipitation)
🔹 مرحله 1: تهیه نمونه RNA خام
- RNA خام را از یک روش دیگر مانند TRIzol یا ستونی استخراج کنید.
- RNA را در بافر TE یا آب RNase-Free حل کنید.
- غلظت RNA را با NanoDrop (260/280) بررسی کنید.
🔹 مرحله 2: افزودن لیتیوم کلرید (LiCl) برای رسوب‌دهی RNA
- حجم معادل 1/3 از محلول RNA، محلول 8M لیتیوم کلرید اضافه کنید.
- مثال: اگر 30 میکرولیتر RNA دارید، 10 میکرولیتر LiCl 8M اضافه کنید.
- محلول را ورتکس کنید و به‌آرامی مخلوط کنید.
- نمونه را در 4°C به مدت 4 ساعت یا در -20°C به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید.
🔹 مرحله 3: سانتریفیوژ و رسوب‌دهی RNA
- نمونه را در 12,000 × g به مدت 15-20 دقیقه در 4°C سانتریفیوژ کنید.
- رسوب RNA به‌صورت یک لکه سفید در ته لوله ظاهر می‌شود.
- محلول رویی (Supernatant) را به‌آرامی دور بریزید، بدون اینکه رسوب از بین برود.
🔹 مرحله 4: شستشو با اتانول 70%
- 500 میکرولیتر اتانول 70% سرد اضافه کنید و لوله را به‌آرامی ورتکس کنید.
- دوباره سانتریفیوژ در 12,000 × g به مدت 5 دقیقه در 4°C انجام دهید.
- محلول رویی را دور بریزید و اجازه دهید RNA خشک شود.
🔹 مرحله 5: حل کردن RNA و بررسی کیفیت
- RNA خشک‌شده را در 20-50 میکرولیتر آب RNase-Free یا بافر TE حل کنید.
- RNA را در -80°C برای ذخیره‌سازی طولانی‌مدت نگهداری کنید.
✅ بررسی کیفیت و کمیت RNA
- NanoDrop: نسبت جذب 260/280 بین 1.8 تا 2.1 باید باشد.
- ژل آگارز: بررسی تخریب RNA با مشاهده باندهای rRNA.
- RT-qPCR: برای ارزیابی کیفیت در کاربردهای مولکولی.
✅ مزایا و معایب روش لیتیوم کلرید
| ویژگی |
مزیت |
عیب |
| خلوص بسیار بالا |
حذف DNA، پروتئین و پلی‌ساکاریدها |
حذف RNAهای کوچک |
| عدم نیاز به فنل/کلروفرم |
روش ایمن و غیرسمی |
سرعت کمتر نسبت به روش‌های ستونی |
| مناسب برای RNA بلند (mRNA, rRNA) |
قابل استفاده برای RNAهای حساس |
نیاز به انکوباسیون طولانی |
| سازگار با نمونه‌های گیاهی و باکتریایی |
حذف کارآمد آلاینده‌های پلی‌ساکاریدی |
کارایی کمتر برای RNA کوتاه |
🔬 مقایسه روش‌های استخراج RNA
| روش |
خلوص |
سرعت |
ایمنی |
هزینه |
| TRIzol (فنل-کلروفرم) |
بالا |
متوسط |
سمی |
متوسط |
| ستونی (Silica Column) |
بالا |
سریع |
ایمن |
گران |
| مغناطیسی (Beads) |
بسیار بالا |
بسیار سریع |
ایمن |
گران |
| لیتیوم کلرید |
بسیار بالا |
کند |
ایمن |
متوسط |
📌 نتیجه‌گیری: روش لیتیوم کلرید برای حذف آلودگی‌های پلی‌ساکاریدی و جداسازی RNA خالص از نمونه‌های گیاهی و باکتریایی ایده‌آل است.
روش استخراج مستقیم RNA (Direct Lysis RNA Extraction) – تخصصی و قدم‌به‌قدم
🔹 روش Direct Lysis یک تکنیک سریع و کارآمد برای استخراج RNA است که بدون نیاز به مراحل جداسازی فاز آلی (مثل فنل-کلروفرم) یا ستون‌های سیلیکا انجام می‌شود.
🔹 این روش برای استخراج RNA از سلول‌های کشت‌شده، بافت‌های تازه و برخی نمونه‌های حساس کاربرد دارد.
🔹 Direct Lysis معمولاً برای کاربردهایی مثل RT-qPCR که به RNA خالص در کمترین زمان نیاز دارند، استفاده می‌شود.
📌 مواد و تجهیزات مورد نیاز
✅ مواد شیمیایی:
- بافر لیز (Lysis Buffer): حاوی گوانیدینیوم تیوسیانات و دترجنت‌ها برای دناتوره کردن RNaseها و تخریب غشاها.
- مهارکننده RNase (RNase Inhibitor): برای جلوگیری از تجزیه RNA.
- دی‌اتیل پیروکربنات (DEPC-Treated Water): برای جلوگیری از آلودگی RNase.
- بافر الویشن (Elution Buffer) یا آب RNase-Free: برای حل کردن RNA استخراج‌شده.
✅ تجهیزات:
- سانتریفیوژ یخچال‌دار (12,000 × g یا بیشتر)
- ورتکس میکسر
- پیپت‌های فیلتر‌دار برای جلوگیری از آلودگی RNase
- هود تمیز (RNAse-Free Workstation)
- انکوباتور یا بلاک حرارتی (اختیاری، برای افزایش بازده استخراج RNA)
🔬 مراحل استخراج RNA با روش لیز مستقیم (Direct Lysis)
🔹 مرحله 1: آماده‌سازی نمونه
🔸 برای سلول‌های کشت‌شده:
- محیط کشت را به‌آرامی خارج کنید.
- سلول‌ها را با PBS شسته و به مقدار مناسب بافر لیز (200-500 میکرولیتر) اضافه کنید.
- مخلوط را ورتکس کنید تا لیز کامل شود.
🔸 برای بافت‌ها:
- 50-100 میلی‌گرم بافت را خرد کنید.
- به آن 500-1000 میکرولیتر بافر لیز اضافه کنید.
- نمونه را با هموژنایزر پردازش کنید تا سلول‌ها کاملاً تخریب شوند.
🔹 مرحله 2: دناتوراسیون RNase و آزادسازی RNA
- نمونه‌های لیز شده را روی یخ نگه دارید تا فعالیت RNaseها مهار شود.
- 5-10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
- برای افزایش کارایی، می‌توانید نمونه‌ها را به مدت 5 دقیقه در 55-65°C انکوبه کنید.
🔹 مرحله 3: شفاف‌سازی (Clarification) برای حذف باقی‌مانده سلولی
- نمونه‌ها را در 12,000 × g به مدت 10 دقیقه در 4°C سانتریفیوژ کنید.
- رسوب سلولی را دور بریزید و مایع رویی را جدا کنید.
🔹 مرحله 4: شستشو و تغلیظ RNA (اختیاری، برای خلوص بیشتر)
- به مایع رویی حجم معادل ایزوپروپانول 100% اضافه کنید.
- نمونه را به‌آرامی ورتکس کنید و 10 دقیقه در -20°C انکوبه کنید.
- سانتریفیوژ در 12,000 × g به مدت 10 دقیقه در 4°C
- محلول رویی را دور بریزید و RNA را با اتانول 70% بشویید.
- RNA خشک‌شده را در 20-50 میکرولیتر آب RNase-Free حل کنید.
🔹 مرحله 5: بررسی کیفیت و کمیت RNA
- NanoDrop: نسبت جذب 260/280 باید بین 1.8 تا 2.1 باشد.
- ژل آگارز: بررسی کیفیت RNA و نبود DNA.
- RT-qPCR: برای تأیید عملکرد RNA در آزمایشات بیولوژی مولکولی.
✅ مزایا و معایب روش Direct Lysis
| ویژگی |
مزیت |
عیب |
| سرعت بالا |
استخراج در کمتر از 30 دقیقه |
خلوص کمتر نسبت به روش‌های دیگر |
| عدم نیاز به حلال‌های آلی |
ایمن و غیرسمی |
احتمال باقی‌ماندن DNA و پروتئین |
| مناسب برای RT-qPCR |
RNA برای کاربردهای فوری آماده است |
مناسب نبودن برای RNAهای با کیفیت بالا |
| سازگاری با سلول‌های حساس |
استخراج RNA از نمونه‌های کوچک و حساس |
محدودیت در جداسازی RNA از نمونه‌های پیچیده |
🔬 مقایسه روش‌های استخراج RNA
| روش |
خلوص |
سرعت |
ایمنی |
هزینه |
| TRIzol (فنل-کلروفرم) |
بالا |
متوسط |
سمی |
متوسط |
| ستونی (Silica Column) |
بالا |
سریع |
ایمن |
گران |
| مغناطیسی (Beads) |
بسیار بالا |
بسیار سریع |
ایمن |
گران |
| لیتیوم کلرید |
بسیار بالا |
کند |
ایمن |
متوسط |
| لیز مستقیم (Direct Lysis) |
متوسط |
بسیار سریع |
ایمن |
کم |
📌 نتیجه‌گیری: روش Direct Lysis برای استخراج RNA سریع و مناسب برای RT-qPCR است، اما برای کاربردهای نیازمند RNA با خلوص بالا توصیه نمیشود.
